O que é espectroscopia de fluorescência?

Por Paul Heney | 3 de maio de 2023

A espectroscopia de fluorescência é um método para determinar a composição de uma amostra. Ele excita uma amostra com radiação eletromagnética, fazendo com que ela emita radiação característica. Este é um método não destrutivo de análise da composição da amostra. Os instrumentos usados ​​para realizar espectroscopia de fluorescência são conhecidos como fluorômetros. Mais comumente, a amostra é excitada usando luz ultravioleta e a luz emitida está no espectro visível. Fluorômetros de raios X também são usados ​​para análise elementar. A espectroscopia de fluorescência é usada em muitos campos, incluindo bioquímico, médico e qualidade da água.

A fluorescência é um processo pelo qual as substâncias absorvem e reemitem radiação. As moléculas têm diferentes níveis de energia determinados pela posição dos elétrons dentro das camadas e pelos estados vibracionais. Quando uma molécula é excitada pela absorção de um fóton de radiação eletromagnética, ela armazena essa energia momentaneamente, saltando para um estado de energia mais elevado, com um elétron movendo-se para uma camada mais distante do núcleo. Devido à atração elétrica entre o elétron e o núcleo, o elétron volta rapidamente ao estado de energia mais baixo e a energia é liberada na forma de um fóton. Esses fótons liberados são a radiação reemitida – e têm uma frequência característica do estado vibracional único da molécula.

A espectroscopia de fluorescência pode ser realizada por fluorômetros de filtro ou espectrofluorômetros. Os fluorômetros de filtro usam filtros para separar a radiação de excitação da luz fluorescente emitida. Os espectrofluorômetros usam um monocromador com rede de difração para separar a excitação e a luz fluorescente. Em ambos os casos, a fonte de excitação emite radiação de amplo espectro e a banda de frequência é então estreitada por um filtro ou monocromador antes de atingir a amostra. A frequência da luz fluorescente é então determinada passando-a por outro filtro ou monocromador e fotodetector. A amostra apresentará fluorescência em todas as direções, independente do ângulo de radiação de excitação incidente. O detector é, portanto, normalmente posicionado perpendicularmente ao feixe de excitação, a fim de minimizar a luz transmitida ou refletida que atinge o detector.

A fonte de luz de excitação pode ser uma lâmpada de vapor de mercúrio, arco de xenônio, LED ou laser. Uma vantagem de usar um laser é que a banda de frequência muito estreita elimina a necessidade de um monocromador ou filtro de excitação. No entanto, torna o ajuste da frequência muito mais difícil e um tanto limitado. Um monocromador com uma rede de difração mecanicamente escaneável e filtros de polarização pode ser ajustado para varrer uma ampla faixa de comprimentos de onda.